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Services

Préparation d'échantillons

Sample preparation

La Plateforme de Protéomique possède l'équipement nécessaire pour effectuer de multiples traitements sur vos échantillons pour optimiser la qualité des expériences protéomiques. Cela inclut l'extraction des protéines à partir de sources variées (cellules, tissus, fluides biologiques, etc.); la digestion à la trypsine des protéines, que ce soit en gel (un procédé optimisé sur notre station robotisée), sur billes ou en solution; les étapes d'enrichissement comme la déplétion du sérum ou l'enrichissement des phosphopeptides à l'aide de TiO2; les étapes de purification comme la déglycosylation ou le dessalage; la séparation des peptides hors-ligne par chromatographie en phase inversée en haut pH; le marquage isobarique des protéines par iTRAQ ou TMT.

Si vous avez des questions ou des requêtes concernant les protocoles qui seront utilisés pour vos échantillons, s'il-vous-plaît contactez-nous. Pour plus d'information sur les coûts associés à certaines étapes spécifiques de préparation, consultez nos prix.

Identification de protéines

Protein identification on a Triple TOF 5600+ (SCIEX)

Une identification de protéine par spectrométrie de masse dite 'bottom up' ou 'shotgun' fournit une bonne image du contenu protéique d'un échantillon: dans des échantillons complexes, des milliers de protéines sont régulièrement identifiées. Notre processus typique inclut la digestion des protéines à la trypsine, l'injection des peptides digérés dans un système HPLC (high pressure liquid chromatography) couplé à un spectromètre de masse à haute résolution et haute précision (présentement, un TripleTOF 5600+ ou un Orbitrap Fusion). Les résultats sont ensuite interprétés par des logiciels spécialisés pour fournir la liste des peptides associés aux spectres ms2 et des protéines associées à ces peptides. Les résultats sont fournis dans un document "Scaffold", qui permet l'exploration et la visualisation du jeu de données dans le visualisateur gratuit de Proteome Software. Le visualisateur Scaffold est un logiciel de haute qualité qui est disponible gratuitement pour la visualisation des jeux de données et qui est compatible avec les systèmes d'exploitation Windows, Mac et Linux. Ce logiciel permet aussi d'exporter les résultats en format texte ou Excel.

La Plateforme de Protéomique dispose de plusieurs spectromètres de masses et de plusieurs logiciels d'analyse, ce qui nous permet de construire des pipelines d'analyses parfaitement ajustés à vos échantillons et vos hypothèses scientifiques. Contactez-nous pour établir le plan d'une expérience de protéomique pour votre projet de recherche.

Étude des modifications post traductionnelles (PTM)

Loading the Orbitrap Fusion HPLC

Certaines modifications post-traductionnelles (PTM) peuvent être observées lors d'une expérience d'identification de protéines par spectrométrie de masse. Ces modifications incluent des PTMs qui jouent des rôles biologiques importants comme les phosphorylations, acétylations, méthylations, ubiquitinylations, etc. Cependant, la stoichiométrie de la modification est souvent basse et il est fréquent que la forme modifiée du peptide ne soit pas fragmentée puisqu'elle est beaucoup moins abondante que la forme non modifiée. Si vous voulez confirmer un site précis de modification ou vérifier un site de modification potentiel, nous vous suggérons de nous en avertir à l'avance et de nous envoyer la séquence de la protéine et le site d'intérêt. Nous pourrons alors cibler spécifiquement le peptide modifié durant l'analyse: en choississant préférentiellement la masse du peptide modifié pour fragmentation, le spectromètre augmente beaucoup la probabilité d'acquérir un spectre MS/MS pour cette forme du peptide.

Des étapes d'enrichissement peuvent aussi maximiser l'observation de certains types de modifications. Par exemple, un enrichissement des phosphopeptides sur billes au dioxide de titane augmentera la couverture des phosphopeptides observés.

Certaines modifications post-traductionnelles, comme les glycosylations, peuvent prendre plusieurs formes. L'identification de ces modifications pose un défi particulier pour la spectrométrie de masse. La Plateforme de Protéomique développe présentement un protocole pour l'identification et la quantification des glycosylations. Si l'étude des glycosylations est importante pour votre projet de recherche, contactez-nous.

Protéomique quantitative

QTRAP 6500 (SCIEX)

La comparaison des concentrations de protéines entre des échantillons de différentes conditions et la mesure de la concentration spécifique d'une protéine occupent une place centrale dans plusieurs projets de recherche. La Plateforme de Protéomique offre des services de quantification relative ou absolue par protéomique ciblée de même qu'une variété de protocols pour la quantification relative par marquage isobarique (iTRAQ, TMT, SILAC) et par approche sans marquage (mesure de l'intensité de l'ion précurseur, approche SWATH et DIA).

Protéomique ciblée (MRM/SRM ou PRM)

La protéomique ciblée par SRM ou MRM (Single Reaction Monitoring ou Multiple Reaction Monitoring) est la référence pour la quantification de protéine et elle est la seule technique de spectrométrie de masse permettant une mesure absolue de la quantité d'une protéine. Dans cette technique, des peptides de la protéine d'intérêt sont exclusivement ciblés par notre spectromètre de masse le plus sensible (présentement, un QTRAP 6500). Cela permet une quantification relative très fiable et très sensible. Pour une quantification absolue, des peptides synthétiques marqués isotopiquement sont ajoutés et utilisés comme standards. (À noter: pour chaque protéine ciblée, le choix des peptides peut devoir être optimisé pour augmenter la sensibilité du test.)

Lors d'une expérience traditionnelle de SRM ou MRM, jusqu'à 50 protéines peuvent être quantifiées en une seule injection. Nous avons aussi optimisé un protocole de PRM (Parallel Reaction Monitoring) sur notre Orbitrap Fusion. Cette technique peut être une alternative intéressante au MRM pour la protéomique ciblée sur un nombre plus important de protéines.

Quantification par marquage isobarique

La quantification par marquage isobarique utilise des isotopes pour différencier les signaux générés par des échantillons de différentes conditions analysés simultanément sur le spectromètre. Ces signaux sont ensuite comparés pour obtenir le ratio des concentrations d'une protéine dans différentes conditions. La Plateforme de Protéomique offre la quantification basée sur marquage par réactif iTRAQ de Sciex (qui permet de comparer jusqu'à 8 conditions) et par réactif TMT de Thermo (qui permet de comparer jusqu'à 10 conditions).

Notre forfait de quantification par marquage iTRAQ ou TMT inclut l'extraction des protéines et la digestion tryptique, le marquage des peptides avec réactifs iTRAQ ou TMT, la séparation hors-ligne des peptides marqués par chromatographie en phase inversée à haut pH (en général, 14 fractions sont générées, mais cela peut être ajusté en fonction de la complexité de l'échantillon), l'analyse sur un spectromètre Orbitrap Fusion et l'identification et la quantification des protéines par des logiciels bioinformatiques. Les résultats générés détaillent les protéines identifiées et leur abondance relative dans chacune des conditions testées. Nous pouvons fournir le même service pour la quantification par marquage SILAC, à la différence que le marquage devra alors être fait par l'équipe qui cultive les cellules.

Quantification sans marquage

Les techniques de quantification relative sans marquage sont de plus en plus populaires et elles ne requièrent pas l'utilisation de standard ou d'isotopes. Une façon d'obtenir une quantification relative des protéines consiste à comparer les aires sous la courbe des ions précurseurs associés à des peptides identifiés dans les conditions comparées. Des chromatographies plus longues (2 à 5 heures) peuvent être effectuées pour maximiser l'efficacité de cette approche. Le logiciel MaxQuant est ensuite utilisé pour analyser les données de ce type. Cette stratégie est bien adaptée pour des échantillons peu complexes, comme ceux obtenus par immunoprécipitation par exemple.

Une nouvelle famille d'approches dites "Data Independent Acquisition" (ce qui inclut la technique SWATH) permettent la détection et la quantification de (potentiellement) tous les analytes présents dans l'échantillon. Cette famille de techniques implique de programmer le spectromètre de masse pour balayer à répétition la plage complète des ratio m/z détectables. Cette stratégie est appropriés pour les échantillons peu ou moyennement complexes. Jetez un coup d'oeil à cet article pour une comparaison des méthodes de quantifications SWATH et iTRAQ: Bourassa et al. 2015.

Caractérisation rapide de peptides

MALDI TOF-TOF 4800 (SCIEX)

Pour une caractérisation rapide d'un peptide ou la confirmation de la séquence de peptides dans un échantillon peu complexe, la technologie MALDI peut être utilisée sur notre spectromètre MALDI TOF-TOF 4800. Les échantillons sont alors déposés sur plaque avec une matrice ionisante et sont ionisés par laser. Cette technique permet de réaliser des pipelines d'analyse à très grand débit qui sont particulièrement appropriés pour les études de validation sur de très nombreux échantillons.

Imagerie MALDI

MALDI Imaging on Synapt G2-SI (Waters)

La Plateforme de Protéomique, en collaboration avec le Laboratoire PRISM de l'Université de Lille, développe présentement de nouveaux protocoles pour l'imagerie MALDI sur un Synapt G2-SI. La technique d'imagerie MALDI permet de visualiser la distribution spatiale des protéines (et d'autres molécules) sur une fine tranche de tissu. Une telle visualisation est extrêmement utile pour comprendre la progression de certains cancers ou les processus d'action des médicaments.

Analyse bioinformatiques, statistiques ou d'enrichissement fonctionnel

Toutes les expériences d'identification et de quantification réalisées à la Plateforme de Protéomique incluent les analyses bioinformatiques nécessaires pour obtenir des listes validées de protéines et de peptides. Mais nous pouvons aussi réaliser des analyses supplémentaires pour vous permettre d'extraire le maximum d'information de vos données et vous aider à publier vos résultats dans des revues scientifiques à haut facteur d'impact.